Plynulá činnosť srdca je nesporne jednou z najdôležitejších funkcií, ktorá musí byť zabezpečená pre riadne fungovanie ľudského organizmu. Priamym spúšťačom kontrakcie srdcového svalu je prechodné zvýšenie koncentrácie Ca2+ iónov vo svalovej bunke. Tieto ióny sú mobilizované cez otvorené ryanodínové receptory (RYR2) a fungujú ako ich kanály. Aby sme si vedeli dôležitosť týchto procesov lepšie predstaviť, myši so zablokovanou expresiou tohto proteínu zomierali už počas embryonálneho vývoja.
Úloha RYR2 kanála v procese kontrakcie srdcového svalu je zásadná a nezastupiteľná, zdôrazňuje Mgr. Marta Gaburjáková, PhD. (Centrum biovied SAV), zodpovedná riešiteľka projektu Luminálna regulácia srdcového ryanodínového receptora a jej molekulárne mechanizmy. Na zabezpečenie stability rytmickej činnosti srdca je podľa nej potrebné precízne kontrolovať vrátkovanie RYR2 kanála (otváranie a zatváranie).
„K hlavným regulačným doménam patrí objemná cytoplazmatická hlavička kanála, na ktorej sú lokalizované väzbové miesta pre viaceré regulátory ako napr. Ca2+ ióny, ATP a kofeín. Počas posledných 20 rokov sa zistilo, že dôležitú regulačnú úlohu má aj opačná strana RYR2 kanála, ktorá je vystavená Ca2+ iónom uskladneným v lumene vnútrobunkových Ca2+ zásobníkov. Molekulárny mechanizmus tohto regulačného procesu sa v súčasnosti intenzívne skúma, pretože jeho narušenie spôsobené bodovými mutáciami na RYR2 kanáli sa spája s generovaním život ohrozujúcich srdcových arytmií. Zákernosť tohto genetického ochorenia je v tom, že sa v pokoji počas EKG vyšetrenia neprejavuje. Arytmie sa generujú iba počas fyzickej aktivity alebo emočného stresu, kedy sa do krvi vylučujú katecholamíny.“
Cieľom uvedeného projektu je získanie kvalitatívne nových informácií o luminálnej regulácii RYR2 kanála, ktoré by vedcom zásadným spôsobom umožnili pochopiť detaily molekulárneho mechanizmu.
„Boli navrhnuté dva základné koncepty. Každý z nich preferuje inú stranu RYR2 kanála (cytoplazmatickú alebo luminálnu) ako hlavnú interakčnú doménu pre luminálne Ca2+ ióny, ktoré môžu voľne prechádzať kanálom v smere lumen-cytoplazma. Najnovšie poznatky o štruktúre RYR2 kanála, nám umožňujú využiť trojmocné katióny na vyblokovanie Ca2+ väzbových miest oddelene na luminálnej a cytoplazmatickej strane RYR2 kanála. Predpokladáme, že získané výsledky by nám mali odpovedať na otázku, ktorý z navrhnutých mechanizmov je dominantný, resp. či navzájom koexistujú alebo kompetujú. Okrem čisto biofyzikálneho prístupu je našou snahou aj posúdenie fyziologickej relevancie jednotlivých mechanizmov v experimentálnych podmienkach, ktoré simulujú prostredie v srdcovej svalovej bunke,“ vysvetľuje zodpovedná riešiteľka.
Hlavným experimentálnym prístupom je podľa nej metóda rekonštitúcie iónového kanála v planárnej lipidovej membráne. „Podstata tejto náročnej elektrofyziologickej metódy je nahradenie prirodzenej bunkovej membrány, v ktorej je zabudovaný RYR2 kanál, umelým systémom, a to planárnou lipidovou membránou (BLM). BLM formujeme na rozhraní dvoch vodných fáz a po úspešnej inkorporácii RYR2 kanála zaznamenávame prúdy iónov, ktoré pretekajú otvoreným kanálom.“
V súčasnosti vedci finalizujú prácu na projekte, analyzujú a pripravujú dáta na publikovanie. „Podarilo sa nám priniesť silné dôkazy o dominantnej úlohe luminálnej strany RYR2 kanála v jeho regulácii luminálnymi Ca2+ iónmi. Získané výsledky jednoznačne podporujú existenciu Ca2+ väzbových miest priamo na luminálnej strane RYR2 kanála. Blokačný účinok trojmocných katiónov na luminálnej strane môžeme pripísať iba interakcii s luminánou stranou RYR2 kanála, pretože trojmocné katióny neprechádzajú vodivým pórom RYR2 kanála. Použitie trojmocných katiónov nám prinieslo výsledky s porovnateľnou vedeckou hodnotou ako tie, ktoré by sme získali generovaním mutovaných RYR2 kanálov s narušenou väzbovou afinitou pre Ca2+. Nami navrhnutá experimentálna stratégia má veľkú výhodu v tom, že je omnoho lacnejšia ako metóda bodových mutácií a v neposlednej rade nám poskytuje väčšiu flexibilitu, pretože blokačný účinok trojmocných katiónov je vymývateľný,“ priblížila Mgr. Marta Gaburjáková, PhD.
Súčasťou projektu je spolupráca s dr. Janosom Almassym z Maďarska (University of Debrecen). Dr. Almassy je molekulárny fyziológ, ktorý má bohaté skúsenosti s použitím trojmocných katiónov v elektrofyziológii ionových kanálov. V rámci riešeného projektu s ním naši vedci konzultovali výber najvhodnejších experimentálnych podmienok, aby zabezpečili jednoznačnú interpretáciu získaných výsledkov.
Ako ešte dopĺňa Mgr. Marta Gaburjáková, PhD., RYR2 kanál sa v posledných rokoch stal novým atraktívnym targetom pre farmakologické intervencie v rámci personalizovanej medicíny v oblasti kardiológie. „Aby bolo možné vyvinúť nové, účinnejšie a predovšetkým selektívne liečivá s minimom nežiadúcich účinkov, je kľúčové detailne pochopiť všetky aspekty regulácie RYR2 kanála vo fyziológii, ako aj v patofyziológii.“
Projekt je financovaný z prostriedkov agentúry VEGA zo Slovenska (2017 – 2019) a rieši sa v Centre biovied SAV (Bratislava) na Oddelení biofyziky a elektrofyziológie. Riešiteľský tím je tvorený dvomi vedeckými pracovníčkami: Mgr. Martou Gaburjákovou, PhD. (vedúca projektu) a Mgr. Janou Gaburjákovou, PhD. Do riešenia projektu boli na Slovensku zapojení aj bakalaranti a diplomanti z Prírodovedeckej fakulty UK a Fakulty matematiky, fyziky a informatiky UK: Bc. Veronika Dreveňáková a Bc. Monika Drozdová.
Odborný garant textu a fotografie poskytla: Mgr. Marta Gaburjáková, PhD., Centrum biovied SAV
Spracovala: Slávka Cigáňová (Habrmanová), NCP VaT pri CVTI SR
Uverejnila: VČ