Testovanie na zvieratách je out, nové metódy sú lepšie aj pre ľudí

Galina Lišháková

Slovensko o nich chystá sympózium s účasťou svetových kapacít. Približuje ich jeho garantka, toxikologička Helena Kanďárová.

Helena_Kanďárová_toxikologička_FOTO_Richard Filipko_týždenník Téma

Toxikologička Helena Kanďárová. Foto: Richard Filipko z týždenníka Téma. Zdroj: archív H.K.

Sympózium o implementácii inovatívnych a medzinárodne uznávaných prístupov pre hodnotenie toxicity látok, pri ktorých nie sú potrebné testy na laboratórnych zvieratách, spoluorganizujú odbor bezpečnosti potravín a výživy Ministerstva pôdohospodárstva a rozvoja vidieka SR (MPRV SR) a Slovenská toxikologická spoločnosť SETOX.

Uskutoční sa online v dňoch 24. – 25. mája 2021 a spojí účastníkov a účastníčky so špičkovými vedcami a vedkyňami z Organizácie pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD), Európskej chemickej agentúry (ECHA) a Európskeho úradu pre bezpečnosť potravín (EFSA). Diskusie o používaní alternatívnych metód v strednej a východnej Európe sa zúčastnia odborníci a odborníčky z výskumných a vedeckých inštitúcií zo Slovenska a okolitých štátov.

Vzhľadom na medzinárodný charakter má sympózium názov v angličtine Dissemination and implementation of the OECD in vitro and in silico methods applicable to the safety and risk assessment of the chemicals, food, and feed (v preklade znamená Šírenie a implementácia OECD metód in vitro a in silico použiteľných na hodnotenie bezpečnosti a rizika chemikálií, potravín a krmív).

Dr.rer.nat. Ing. Helena Kanďárová, ERT, odborná garantka tohto sympózia, je toxikologičkou v Ústave experimentálnej farmakológie a toxikológie Slovenskej akadémie vied, predsedníčkou Európskej spoločnosti pre toxikológiu in vitro ESTIV a podpredsedníčkou Slovenskej toxikologickej spoločnosti SETOX.

Minulý rok získala významné medzinárodné ocenenie LUSH Prize – Comended project, ktoré sa udeľuje za iniciatívy smerujúce k náhrade testov na zvieratách, najmä v oblasti toxikológie. Toxikologička sa im venuje od začiatku svojej vedeckej dráhy. Zaujímavý príbeh jej vedeckej kariéry sme priblížili na našom portáli v texte Pes ani mačka nie je žiadna hračka. Výskum doktorky Heleny Kanďárovej prispieva k zníženiu počtu testov na zvieratách.

V aktuálnom rozhovore s Helenou Kanďárovou sa dočítate:

  • ako prechádzajú aj ostatné krajiny sveta vplyvom Európskej únie (EÚ) na alternatívne metódy a inovatívne postupy testovania chemických látok, ktoré nahrádzajú testy na laboratórnych zvieratách,
  • aké alternatívne metódy sa používajú a akým schvaľovacím mechanizmom podliehajú,
  • prečo sú pre človeka tieto metódy bezpečnejšie,
  • ako v tomto smere napreduje Slovensko.

Hlavným dôvodom organizácie tohto sympózia bola potreba šíriť aktuálne informácie o takzvaných alternatívnych metódach a inovatívnych prístupoch, ktoré obmedzujú alebo úplne nahrádzajú používanie zvierat v toxikologických štúdiách. Narastá vo svete záujem o tieto postupy?

Áno. V Európskej únii už v tomto smere máme jednotný postup, pretože platí, že ak niečo uzákoní európska legislatíva, automaticky to platí pre všetky členské štáty EÚ. Samozrejme, keď je niečo implementované v legislatíve EÚ, napríklad to, že sa do nej nesmú dovážať finálne kozmetické výrobky testované na zvieratách, má to dosah aj na iné štáty, napríklad USA, Čínu či Rusko. I keď napríklad v USA sa testovanie kozmetiky na zvieratách v niektorých štátoch stále vyžaduje, iné sa proti nemu postavili. Napríklad v Kalifornii v roku 2018 vyšiel zákon, na základe ktorého sa finálna kozmetika na zvieratách nebude testovať, čo v roku 2019 uzákonili aj v štáte Illinoise.

Znamená to, že EÚ je v týchto zmenách lídrom a nepriamo vytvára tlak na štáty, ktoré nové metódy nepoužívajú?

Áno, pretože na trh EÚ sa síce dováža aj kozmetika z USA či Ruska, ale od roku 2004 platí, že nemôže byť testovaná na zvieratách. EÚ je nielenže lídrom v oblasti vývoja a validácie alternatívnych metód, ale veľmi dlho v nej bola nedostihnuteľná, avšak USA ju veľmi rýchlo dobieha a v niektorých smeroch ju už aj predbehli. Ide o pomerne rýchlu implementáciu inovatívnych technológií a konceptov hodnotenia rizík. USA nasadili v niektorých oblastiach také tempo, že EÚ ich bude mať problém dobehnúť. Príkladom môže byť program TOX 21  – Toxikológia pre 21. storočie, ktorý spája niekoľko federálnych inštitútov, ako je US EPA (Agentúra pre ochranu životného prostredia), NIH (Národný zdravotný inštitút), NTP at NIEHS (Národný toxikologický program pri Národnom inštitúte environmentálneho zdravia), US FDA (Americká lieková agentúra) a iné významné inštitúcie v USA s cieľom vyvinúť lepšie a efektívnejšie spôsoby hodnotenia rizík chemických látok a ich vplyvy na ľudské zdravie i životné prostredie. Je to koordinovaný prístup, ktorý je tiež podporený adekvátnym financovaním projektov a validačných štúdií.

Znie to, ako keby USA a EÚ v tomto smere medzi sebou súťažili. Alebo si chcú vymieňať potrebné informácie, aby sa zjednotili v poznatkoch a postupoch?

K tomu, aby sa informácie v tomto smere vymieňali a zavádzané postupy zjednocovali, slúži napríklad OECD, ktorá má veľký záujem o zavedenie týchto inovácií do takzvaných OECD Test Guidelines (testovacích nariadení). Samozrejme, ak sa niektorá členská krajina OECD rozhodne, že do niektorých oblastí nechce niektorú z metód OECD implementovať stopercentne, sú možné určité výnimky. Tieto sa vzťahujú napríklad na existenciu rozdielnych klasifikačných systémov. Tie vidíme napríklad v oblasti pesticídov, kde sú veľké rozdiely v klasifikácii rizík alebo v regulácii niektorých látok pod inou legislatívou. Napríklad v USA kozmetické UV filtre reguluje FDA (Americká lieková agentúra), v EÚ je to kozmetická surovina, ktorá spadá pod kozmetickú a chemickú legislatívu.

Adrian Pflug, moderátor TV Arte nakrúca s Helenou Kanďárovou na kongrese EUSAAT v Linzi (asi 2015) rozhovor o alternatívnych metódach pre vedecký televízny program Xenius. Zdroj: Archív H.K.

Adrian Pflug, moderátor TV Arte, nakrúca s Helenou Kanďárovou rozhovor o alternatívnych metódach pre vedecký televízny program Xenius na kongrese EUSAAT v Linzi (asi 2015). Zdroj: archív H.K.

Metódy, ktoré dokážu nahradiť testy na laboratórnych zvieratách, sú založené na viacerých postupoch, ktoré môžu laikovi znieť zložito. Priblížte, prosím, zjednodušene, čo znamenajú. Napríklad keď sa bavíme o metóde využitia bunkových a tkanivových kultúr (takzvaných in vitro systémoch), ide o bunky ľudského organizmu, na ktorých sa testuje účinok chemikálií v Petriho miskách?

Môže ísť o bunky ľudského alebo živočíšneho pôvodu, v niektorých oblastiach sa využívajú aj ex vivo a in vitro 3D tkanivá (najmä živočíšneho pôvodu), ale aj rastlinné pletivá. No v in vitro toxikológii sa už väčšinou nepracuje v Petriho miskách, pretože bežné sklo nie je najideálnejším materiálom na rast bunkových kultúr. V súčasnosti robíme testy na sterilných plastoch rôznych tvarov a veľkostí, ktoré sú pokryté špeciálnymi látkami umožňujúcimi rast buniek v optimálnych podmienkach.

Ako sa tieto tkanivá získavajú?

Ľudské tkanivá sú podarované pre účely vývoja a výskumu. Každý darca podpisuje informovaný súhlas. Napríklad keď chcete kultivovať rekonštituovanú ľudskú pokožku (napríklad pre výskum kožnej dráždivosti), primárna kultúra buniek pochádza z plastických operácií alebo z obriezok. Živočíšne tkanivá pochádzajú zo zvierat, ktoré boli humánne usmrtené, a až potom sa urobil odber ich tkanív a orgánov pre vedecké účely.

Ďalšou metódou je využitie organoidov. Čo sú to organoidy?

To sú štruktúry, ktoré napodobňujú časť orgánu, z ktorého pochádzajú. Dajú sa vytvoriť napríklad organoidy pečene, ktoré sú veľmi častým modelom pre štúdium hepatotoxicity (toxicity pre pečeň), ale, samozrejme, vytvoriť sa dajú aj iné. Väčšinou sú vo forme malých guličiek, ktoré nazývame sferoidy.

Ako si možno predstaviť mikrofluidické čipy, ktoré sa v tomto smere tiež používajú?  

Sú to zariadenia, ktoré umožňujú tok kultivačného média cez testovací systém in vitro. Predstavte si ich ako komôrky, v ktorých rastie in vitro kultúra a kultivačné médium (čiže substrát poskytujúci výživu) je pod ňou, nad ňou alebo na ňu pôsobí z oboch smerov. Zistilo sa, že keď je v mikrokultúrach zapojená mikrofluidika, často majú lepšiu vypovedaciu schopnosť ako keď rastú v statických podmienkach. Takisto morfológia (tvar) rôznych organoidov je lepšia v porovnaní s tým, keď sú v statických podmienkach (čiže, keď sa testy robia na plastových doštičkách bez prietoku média).

Vďaka všetkým týmto modelom teda vedci už mnohé testy nemusia robiť na laboratórnych zvieratách. Pomáhajú im ale aj pokročilé počítačové simulácie a databázy? Ako? 

V podstate to celé začína pri databázach. Keď chcete robiť simulácie, musíte mať dobrý základ informácií. Prvý krok potrebný pre vybudovanie takej databázy je získanie dostatočných informácií o fyzikálno-chemických vlastnostiach látok, výsledkoch in vivo (v organizme) ako aj in vitro. Mnohokrát sa do týchto databáz dostanú len výsledky zo štandardizovaných in vitro pokusov, ktoré sa robia v systéme SLP, čo je skratka pre Správnu laboratórnu prax.

Čo to znamená?

Je to systém určitých postupov a dokumentácie, ktorým sa riadi, ale aj popisuje štúdia. Aj dáta z experimentov na zvieratách by mali pochádzať pre účely modelovania zo SLP štúdií. Je to veľmi dôležité preto, že keď máme príliš veľkú variabilitu, či už v in vivo, alebo v in vitro výsledkoch, databáza má nižšiu kvalitu a následné predikcie (predpovede – pozn. red.) na základe počítačového modelovania, ktoré sa urobia na základe týchto dát, nemusia byť presné.

Výsledky experimentov, ktoré sa získavajú v režime SLP, majú vysokú výpovednú hodnotu. Vďaka nim totiž vieme spätne vysledovať, akú mala testovaná látka koncentráciu, akou metódou sa testovala, akým prístrojom, kto to robil aj kedy. Je to veľmi dôležité taktiež pri posudzovaní celkového výsledku danej štúdie, ale aj následného modelovania predpovede pre štrukturálne podobné látky.

Napríklad regulačné orgány, ako je ECHA, EFSA alebo OECD pri posudzovaní štúdií, vždy prihliadajú na to, či boli urobené v systéme SLP. Stáva sa, že štúdie, ktoré v ňom neboli urobené, neakceptujú.

Znamená to, že dobré počítačové databázy ešte urýchlia a upresnia testovanie látok, ktoré sa používajú v chemickom či kozmetickom priemysle?

Áno, keď máme k dispozícii presnú chemickú štruktúru látky, jej kľúčové fyzikálne i chemické vlastnosti a in vitro a in vivo dáta z predchádzajúcich experimentov so štrukturálne podobnou látkou, je to dôležité. Matematici vedia na základe týchto informácií predpovedať, ako približne sa nám môže chemikália z hľadiska toxicity, ale aj žiadaného účinku (liečivá) správať.

Pretože poznáme rôzne špecifické toxicity (pre rôzne orgány) aj databázy sa špecifikujú na rôzne predikcie toxicít. Aby sme o látke  získali komplexnú informáciu, treba prejsť rôzne databázy. Až na základe výsledkov z týchto databáz sa pristupuje k celkovému hodnoteniu bezpečnosti. V súčasnosti máme systémy umelej inteligencie, ktoré vedia odhaliť napríklad aj nekonzistentnosť dát, čiže ak si vzájomne odporujú výsledky in vivo a in vitro. Na základe ďalších informácií o podobných látkach dokonca vedia odhadnúť, kde mohol nastať problém. My ich potom vieme dotestovať alebo prehodnotiť náš úsudok.

Laboratórna biela myš. Zdroj: iStockphoto.com

Laboratórna biela myš. Zdroj: iStockphoto.com

Účastníci spomínaného sympózia budú môcť vidieť tiež to, ako sa pracuje so softvérmi a databázami OECD a EFSA, ktoré môžu využiť aj pri testovaní toxicity potravín a krmív. Aké látky testuje na laboratórnych zvieratách potravinársky priemysel? A prečo za chemickým a kozmetickým priemyslom v tomto smere zaostáva?

Potravinársky priemysel testuje rôzne adititíva, enzýmy, príchute, stabilizátory, inovatívne potravinárske produkty, celú oblasť geneticky modifikovaných potravín. Tiež má záujem prejsť v tomto smere na alternatívne metódy, ale asi to potrvá trochu dlhšie. Mnohé testy potrebné v tomto smere totiž ešte nevieme robiť in vitro, lebo ich nemáme dostatočne zvalidované. Ale sú iniciatívy, aby sa všade tam, kde je to možné, začali používať validované in vitro metódy.

Validácia je terminus technicus alebo ju môžeme nahradiť slovom overenie?

Je to terminus technicus a v súvislosti s implementáciou alternatívnych metód znamená, že musíme overiť, či je daná metóda dostatočne reprodukovateľná a relevantná. Znamená to, že ju musíme porovnávať s nejakou metodikou, ktorá je už daná v nariadeniach, najčastejšie je to in vivo test na pokusnom zvierati. Ale v limitovaných prípadoch sa berú do úvahy aj štúdie, ktoré majú ľudské dáta. Keď sa robí validácia pre alternatívne metódy, musí poskytnúť dostatočnú informáciu, že metóda in vitro poskytuje také isté údaje alebo lepšie ako etablovaná metóda.

Takéto štúdie sa vykonávajú medzinárodne a majú niekoľko fáz. Zvyčajne sa robí predvalidačná štúdia, ktorú vykonávajú dve až tri laboratóriá s určitým počtom látok a potom nastáva veľká validácia, ktorá metódu spred validácie znovu overí s väčším počtom iných chemických látok. Počet a druh vybraných látok pre štúdie je veľmi významnou súčasťou validácie. O implementácii alternatívnych metód nakoniec rozhodne regulatívny orgán v príslušnej oblasti, čiže čo sa týka implementácie alternatívnych metód pre chemické látky, je to OECD a ECHA (v EÚ). V oblasti zdravotníckych pomôcok je to ISO a národné legislatívne úpravy, potravinárske aditíva a príbuzné témy rieši v EÚ EFSA.

Tieto sektory navzájom pozorujú, ako a kto v alternatívnych metódach pokročil a všade tam, kde je to možné, sa ich snažia implementovať.

Pokrok spočíva nielen v tom, že sa na pokusy prestávajú používať laboratórne zvieratá, ale aj v tom, že alternatívne metódy sa ukazujú pre ľudí bezpečnejšie. Z čoho to vyplýva?

Alternatívne metódy, správnejšie je nazývať ich nové prístupy hodnotenia, sú v súčasnosti veľmi komplexnými stratégiami, ktoré pracujú s obrovským množstvom informácií a ich kombinácií. Čiže vo väčšine prípadov nejde o izolovanú metódu, ktorá nahrádza pokus na zvierati 1 : 1, ale je to batéria in vitro testov doplnená o literárnu rešerš, in silico modelovanie a zahŕňa pochopenie mechanizmov účinku a kľúčových eventov, ktoré vedú k nežiaducim vedľajším účinkom. Čím viac o látke vieme, či už na základe alternatívnych prístupov, alebo klasických in vivo testov, tým lepšie býva zhodnotenie bezpečnosti látok pre užívateľov.

V rozhovore na našom portáli skoro pred rokom ste hovorili nielen o plánoch zorganizovať toto sympózium, ale aj o tom, že by ste chceli v Ústave experimentálnej farmakológie a toxikológie SAV vybudovať in vitro laboratóriá, ktoré budú pracovať v režime Správnej laboratórnej praxe. Ako ste v tomto smere pokročili?

V priebehu minulého roka sa nám podarilo v ústave  etablovať laboratórium tkanivových kultúr, ktoré už pracuje v režime Správnej laboratórnej praxe. Celé naše pracovisko práve úspešne prešlo auditom SLP a dokonca sme sa zapojili aj do siete EU-NETVAL, čo je sieť validačných laboratórií EÚ koordinovaných Spoločným výskumným centrom (JRC) v Ispre. V rámci tejto siete sme sa zapojili do projektu, ktorý sa týka validácie metód pre hodnotenie endokrinných disruptérov (látok, ktoré majú negatívny vplyv na endokrinný systém). Teda to, čo sme si pred rokom naplánovali, úspešne plníme. Dúfam, že sa nám v tomto smere podarí ďalej sa rozvíjať.

Tiež sme získali prestížny grant ONTOX z EÚ schémy H2020, ktorý sa bude zaoberať hodnotením bezpečnosti látok prístupmi, ktoré kombinujú in vitro, in silico a umelú inteligenciu a pomôžu nám nájsť účinné stratégie pre hodnotenie hepato-toxicita (toxicita pre pečeň), nefrotoxicity (toxicita pre obličky) a vývinovej neurotoxicity (forma toxicity, v ktorej biologický, chemický alebo fyzikálny prostriedok/biologická, chemická alebo fyzikálna látka vyvoláva nepriaznivý vplyv na štruktúru alebo funkciu nervového systému), ktoré sú spôsobované opakovanou expozíciou látkam (môžu to byť chemické či biologické látky a aj fyzikálne faktory (radiácia, teplo, hypoxia)).

Zdroj: TS Národného kontaktného bodu pre vedeckú a technickú spoluprácu s EFSA | Odbor bezpečnosti potravín a výživy, Sekcia potravinárstva a obchodu

Zdroj hlavnej foto: www.helenakandarova.com (Richard Filipko/týždenník Téma)

Operačný program MSSR

Investícia do Vašej budúcnosti
Tento projekt je podporený z Európskeho fondu regionálneho rozvoja

Táto webová stránka vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Podpora národného systému pre popularizáciu výskumu a vývoja
(kód ITMS: 313011T136), spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.