Na objave pracovali odborníci štrnásť rokov. Technika by mala byť nielen rýchlejšia, ale aj omnoho lacnejšia. Jej základom sú elektrochemické merania.
Prof. Michal Hocek, Zdroj: Tomáš Belloň / ÚOCHB
Každý človek má jedinečné nielen odtlačky prstov či farbu dúhovky, ale aj genetickú informáciu.
Jej nositeľkou je deoxyribonukleová kyselina (DNA), ktorá riadi rast, delenie či regeneráciu bunky. V bunke je najčastejšie uložená ako dvojzávitnicová špirála, ktorej vlákna majú navzájom opačnú orientáciu fosfodiesterových väzieb.
Genetická informácia sa skladá z niekoľkých základných prvkov, ktoré sa nazývajú nukleotidy. Každý nukleotid má tri základné zložky: fosfátový zvyšok kyseliny fosforečnej, molekulu deoxyribózy a dusíkatú bázu: adenín (A), guanín (G), cytozín (C) alebo tymín (T).
Jednotlivé bázy na vláknach dvojzávitnice DNA sú spojené pomocou vodíkových väzieb, pričom platí takzvaný princíp komplementarity. Znamená to, že adenín sa prednostne páruje s tymínom z druhého vlákna dvojzávitnice a guanín s cytozínom.
Práve kombinácia písmen a ich poradie sú zodpovedné za jedinečnú genetickú informáciu každého tvora.
Rozlúštiť kompletný ľudský genóm pritom nebolo vôbec jednoduché. Vedcom sa to podarilo až v roku 2003, a to vďaka metóde, ktorú v sedemdesiatych rokoch dvadsiateho storočia vyvinul britský biochemik a nositeľ Nobelovej ceny Frederick Sangner.
Sekvenovanie DNA podľa Fredericka Sangnera sa v rozličných formách používa dodnes. Metóda je založená na fluorescenčnom označovaní nukleotidov.
Ilustračné foto: Pravotočivá závitnica DNA. Zdroj: iStock Photo
Hoci je spoľahlivá, mnohí odborníci upozorňujú, že je aj finančne a časovo náročná. Drahé prístroje si zďaleka nemôžu dovoliť všetky pracoviská, ktoré by potrebovali sekvenovať DNA, čo by im umožnilo jednoduchšie diagnostikovať rôzne ochorenia.
Lekári dokonca nepotrebujú vždy prečítať celý genóm pacienta. V mnohých prípadoch im stačí preskenovať len časť genetickej informácie, aby vedeli určiť napríklad typ nádorového ochorenia pacienta, a následne tak pre neho vytvoriť vhodnú liečbu.
Vedci už roky hľadajú spôsob, ako lekárom túto prácu uľahčiť. Po štrnástich rokoch skúmania prichádza s prelomovým objavom medzinárodný tím vedcov pod vedením Michala Hoceka z Ústavu organickej chémie a biochémie Českej akadémie vied a Ciary K. O’Sullivanovej zo španielskej Univerzity Rovira i Virgili.
Výsledky ich výskumu publikoval prestížny odborný časopis Journal of American Chemical Society.
Farbu vystrieda napätie a prúd
Počas Sangnerovej metódy sekvenovania vedci pri dešifrovaní DNA zloženej z písmen A, C, G, T pripájajú ku každej báze značku.
Takto označený nukleotid sa prostredníctvom enzýmu polymerázy pripojí na príslušné miesto sekvencie DNA a už stačí značku len prečítať. Pri fluorescenčnej metóde je touto značkou farba.
Pri novej metóde, ktorá využíva elektrochemické meranie, je postup takmer identický, avšak na ako značka sa nepoužíva farba, ale určitá hladina napätia.
„Namiesto toho, aby sme merali absorpciu a emisiu svetla, meriame prúd. Je to úplne iný fyzikálny prístup, ktorý má jednu významnú výhodu. Nutné prístrojové vybavenie zahŕňa elektródy a meracie zariadenie, čo sú položky pohybujúce sa rádovo v cene tisícky korún, nie miliónoch v porovnaní s drahou fluorescenčnou metódou,” vysvetľuje v tlačovej správe Českej akadémie vied Michal Hocek, jeden z hlavných autorov publikácie.
Všetky štyri bázy naraz
Nový elektrochemický princíp čítania DNA však prináša viacero výhod.
Napríklad zatiaľ čo čítanie fluorescenčných značiek prebieha postupne, jedna po druhej, meraním založenom na elektrochemickom princípe dokážu vedci prečítať všetky štyri bázy naraz.
Odborníkom sa totiž podarilo nájsť také značenie, ktoré si vzájomne nekonkuruje a ľahko rozpoznáva prítomnosť všetkých štyroch typov značiek.
Zobrazenie DNA. Zdroj: iStockphoto.com
Prísť na to, ktoré štyri rôzne molekuly budú vhodnými adeptmi na toto značenie, trvalo vedcom štrnásť rokov.
Dosiahli ho použitím nových značiek založených na karboranových molekulách a už v minulosti použitých značkách na báze ferocénu a deazaguaninu.
„Akonáhle na DNA, na ktorej je naviazaná značka v podobe karboranovej molekuly, aplikujeme elektródu s určitým napätím, v istej chvíli značka zoxiduje a cez elektródu začne prechádzať prúd. Práve ten následne meriame,” objasňuje Michal Hocek.
Prečítajú iba pomer, nie poradie písmen
Za nevýhodu metódy experti považujú to, že elektrochemické meranie neumožňuje určiť presné poradie písmen, len ich pomer v skúmanej sekvencii.
Pre mnoho diagnostických aplikácií to však stačí. Ak by lekár chcel zistiť, či pacient trpí nejakou konkrétnou chorobou a poznal by danú sekvenciu určitej časti DNA zdravého organizmu, výsledné sekvenovanie by prezradilo odchýlku od normálu, napríklad, namiesto dvoch adenínov by bol len jeden adenín a jeden cytozín.
Vedci tiež zdôrazňujú, že metóda síce neumožňuje určiť presnú polohu báz, tento nedostatok vyvažuje však rýchlosť.
Elektrochemické merania poskytnú lekárom výsledok za desiatky minút či niekoľko málo hodín.
Na porovnanie možno uviesť, že prečítať ľudský genóm fluorescenčnou metódou trvá viac ako 24 hodín a výsledky musia odborníci prácne analyzovať pomocou špeciálneho bioinformatického softvéru.
Diagnostická metóda budúcnosti
Sangnerovu metódu používajú lekári už desaťročia. Postupy a prístroje sú optimalizované, odborníci ich využívajú masovo.
Napriek tomu vedci veria, že ich nová metóda by mohla v budúcnosti nájsť svoje uplatnenie.
Skúmavky s DNA. Zdroj: iStockphoto.com
Podľa vyjadrenia Michala Hoceka jeho tím začal v spolupráci so zahraničnými kolegami pracovať na geosenzoroch, ktoré by dokázali paralelne detekovať viacero sekvencií DNA vrátane mutácií. Experti chcú využiť to, že elektródy môžu byť multikanálové, čo im umožní skúmať mnoho sekvencií súčasne.
„Pokiaľ všetko dobre dopadne, mohla by to byť relatívne mocná diagnostická metóda, avšak ešte sme ďaleko od tohto cieľa,” hovorí Hocek.
Zdroje
DOI: 10.1021/jacs.1c02222
