V poslednom období pozorujeme zvýšený počet mutácií v S proteíne SARS-CoV-2, ktoré zvyšujú jeho infekčnosť, ale nie patogenitu. Aký budú mať vplyv na účinnosť PCR testov a vakcín?
Koronavírus preniká do ľudských buniek pomocou spike proteínu k ACE2 receptoru. Zdroj: iStockphoto.com
Pri množení SARS-CoV-2 v bunkách dochádza k jednej až dvom spontánnym náhodným mutáciám v jeho RNA genóme za mesiac. Frekvencia mutácií je menšia, ako napríklad v prípade vírusu chrípky.
Keď táto časť genetickej informácie kóduje syntézu bielkoviny, môže dôjsť aj k mutácii aminokyselín a tým k zmene jej vlastnosti. Okrem iných mutácií, dôležité sú tie, ktoré sa vyskytujú v S (spike) proteíne.
Molekula S proteínu, ktorá tvorí hroty na povrchu vírusu, sa skladá z 1273 aminokyselín organizovaných v S1 a S2 podjednotkách. V S1 podjednotke sa nachádza v polohe medzi aminokyselinami 328 – 533 doména viažuca sa na receptor (RBD – receptor binding domain), ktorá interaguje s receptorom ACE2 na povrchu buniek, čím dochádza k ich infekcii.
A je tu aj miesto, ktoré rozpoznáva enzým furín: proteáza štiepiaca S proteín na S1 a S2 podjednotky (poloha 681 – 685), čo je dôležité pre vývoj infekčného procesu. Mutácie v týchto miestach môžu viesť k zmene biologických vlastnosti vírusu, napríklad infekčnosti a patogenity. Vedci začali pozorovať v S proteíne SARS-CoV-2 viaceré nové mutácie, čím vznikli nové vírusové varianty.
Vírusový variant s mutáciou D614G
Prvá významnejšia mutácia v S proteíne bola zaznamenaná v polohe 614, kde došlo k mutácii kyseliny asparagovej (D) na glycín (G) – mutácia D614G (skratky aminokyselín sú uvedené pod článkom). Kým vírusové varianty mali v období december 2019 až február 2020 v tejto polohe kyselinu asparagovú, od konca marca 2020 je to už glycín.
Mutácia je mimo oblasť RBD, ale vzhľadom na to, že nový vírusový variant ľahšie infikuje ľudí, je v súčasnosti dominantný na celom svete. Našťastie lekári zatiaľ nepozorovali u infikovaných pacientov zhoršený priebeh infekcie (viac v texte SARS-CoV-2 zmutoval a je infekčnejší z júla 2020)
K prenosu vírusu došlo na farmách, kde chovajú norky pre ich vzácne kožušiny. Zdroj: iStockphoto.com
Mutácie vírusu u noriek
Nebezpečnejšie mutácie môžu vzniknúť pri preskoku vírusu na iného hostiteľa. Preto, keď bol v apríli 2020 identifikovaný v Holandsku prenos SARS-CoV-2 z ľudí na farmové norky a neskôr aj na norky v Dánsku, Taliansku, Španielsku, Švédsku a USA, vedci v laboratóriu, epidemiológia v teréne a relevantné štátne riadiace zložky značne spozorneli (European Centre for Disease Prevention and Control: Detection of new SARS-CoV-2 variants related to mink, 12. 11. 2020).
Mali pochopiteľné obavy, že môžu vzniknúť nebezpečné vírusové varianty infikujúce ľudí. Veď v Dánsku, v ktorom sa chová 17 miliónov noriek, bolo v novembri 2020 infikovaných viac ako 200 fariem, čo naznačuje rozsiahle šírenie vírusu v populácii týchto zvierat. Zistená mutácia Y453F, ktorá je lokalizovaná v RBD, je zrejme výsledkom adaptácie vírusu na bunkový receptor ACE2 u noriek.
Nebezpečenstvo ešte vzrástlo po zistení, že tento vírusový variant spätne infikoval aj niekoľkých farmárov, asi ako výsledok zvýšenej afinity zmutovaného vírusu k ľudskému receptoru ACE2. Okrem tejto mutácie sa objavili aj ďalšie mutácie v S proteíne ako sú I692V, S1147L, M1229I, ale aj delécia dvoch aminokyselín, histidínu a valínu, v polohe 69 a 70 S1 podjednotky (69-70deltaHV), ktoré mali epidemiologický vzťah k infikovaným norkám.
Jednotlivé mutácie sa objavovali u variantov buď osobitne alebo aj v rôznych kombináciách. Situáciu zamotáva poznanie, že nie všetky varianty z Holandska mali mutáciu Y453F, čo naznačuje, že asi nie je špecifická len pre norky. Podporujú to aj zistenia, že táto mutácia bola sporadicky zistená aj u vírusu z ľudských pacientov v Rusku, Juhoafrickej republike, Švajčiarsku a USA.
Polovica infikovaných noriek v Dánsku mala deléciu 69-70deltaHV, ktorá nebola zistená v žiadnej vírusovej vzorke u holandských noriek. Naproti tomu táto delécia bez mutácie Y453F bola zistená u ľudských pacientov z Austrálie, Francúzska, Nemecka, Malajzie, Nového Zélandu, Nórska, Švédska a UK.
V Dánsku nepozorovali v ľudskej populácii zvýšenú infekčnosť vírusových variantov z noriek. Potešiteľné je, že pacienti infikovaní zmutovaným vírusom nemali ani ťažší priebeh koronavírusovej infekcie oproti pacientom infikovaným vírusom, ktorý nepochádzal z noriek. Na druhej strane, predbežné experimenty naznačujú, že niektoré zmutované varianty vykazovali zníženú citlivosť k neutralizujúcim protilátkam z COVID-19 pacientov infikovaných na jar 2020.
Pre istotu sa však v Dánsku a Holandsku intenzívne pracuje na likvidácii chovov noriek, aby nedošlo k nekontrolovanému šíreniu pandemického koronavírusu a tým k ďalším zmenám v jeho genóme.
Grafika s popisom jedotlivých častí koronavírusu. Zdroj: iStockphoto.com
Vírusové varianty vo Veľkej Británii
V priebehu októbra – decembra 2020 začali výrazne stúpať počty infikovaných v juhovýchodnom Anglicku, Londýne a sporadicky aj v iných oblastiach Veľkej Británie. Genetická analýza vírusu odkryla prítomnosť nezvyčajne vysokého počtu mutácií v S proteíne, čo sa prejavilo aj vytvorením samostatnej vetvy vo fylogenetickom strome. V S proteíne týchto izolátov boli identifikované delécie 69-70deltaHV a tyrozínu v polohe 144, a tiež mutácie aminokyselín N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H, ako aj ďalších 9 mutácií v iných častiach genómu.
Najviac znepokojivá je mutácia N501Y, ktorá zasiahla jednu zo šiestich kľúčových aminokyselín v RBD, čo má za následok zvýšenú afinitu vírusu k ľudskému receptoru ACE2. Delécia 69-70deltaHV už bola známa a je často spojená aj s inými mutáciami v RBD, napr. s mutáciou Y453F vo vírusových variantoch z noriek v Dánsku a mutáciou N439K v ľudských variantoch z viacerých štátov.
Mutácia P681H je hneď pred štiepacím miestom pre furínovú proteázu a zatiaľ nevieme, ako sa prejavuje na biologickej úrovni. Aj keď doteraz boli pozorované u vírusových variantov mutácie N501Y a P681H nezávislé od seba, v Anglicku je to prvý prípad, keď sa vyskytujú spoločne v jednom variante.
Ukazuje sa, že nový variant vírusu je infekčnejší, šíri sa asi o 70 percent rýchlejšie ako pôvodný vírus, ale nezdá sa, že je aj viac patogénny. Nový variant vírusu bol potvrdený nielen vo Veľkej Británii, ale sporadicky už aj v Dánsku, Austrálii, Belgicku Francúzsku, Taliansku, Nemecku, Holandsku, Rakúsku, Libanone a iných štátoch.
Tento variant už identifikovali aj v USA, pričom pacient nemal cestovateľskú anamnézu. Nie je vylúčené, že výrazný vzostup infekcií na Slovensku v ostatnom období je spôsobený zavlečením infekčnejšieho variantu vírusu, ktorý sa vyskytuje v UK. Prvé prípady infekcie týmto vírusovým variantom už identifikovali aj na Zemplíne.
Sekvenovanie ďalších vírusových vzoriek iste odhalí rozsah rozšírenia nového variantu z Británie na Slovensku. Naši vedci už operatívne pristupujú k vývoju RT-PCR testu, ktorý by rýchlo identifikoval nový variant vírusu, bez nutnosti sekvenovania vírusovej vzorky.
Ilustračná foto: Vakcína proti novému koronavírusu. Zdroj: iStockphoto.com
Vírusové varianty v Juhoafrickej republike a Nigérii
Ďalšia nová fylogenetická skupina vírusových izolátov bola identifikovaná v JAR. Pri analýze vírusových vzoriek z druhej vlny boli v októbri 2020 identifikované v S proteíne popri mutácii D614G aj nové mutácie D80A, D215G, E484K, N501Y a A701V, a pri analýze novembrových vzoriek aj ďalšie mutácie L18F, R246I a K417N a delécia 3 aminokyselín v polohe 242 – 244 (Tegally, H. a kol.: medRxiv – https://doi.org/10.1101/2020.12.21.20248640).
Tri z týchto mutácií, ktoré sú v RBD – K417N, E484K a N501Y, reagujú s receptorom ACE2. Kým mutácia N501Y už bola identifikovaná vo Veľkej Británii a je zrejme spojená s vyššou infekčnosťou vírusu, mutácia E484K je doteraz neznáma, pravdepodobne však pozitívne ovplyvňuje väzbu RBD k ACE2 receptoru.
Ukazuje sa, že vírusové kmene z Nigérie majú tiež zvýšený počet mutácií v S proteíne. Tieto mutácie nie sú identické s mutáciami vo variantoch zistených v Anglicku. Zatiaľ vieme o mutácii P681H, ale na presnejšie dáta si musíme ešte počkať, pretože sekvenovanie izolátov nie je v tejto krajine veľmi rozvinuté.
Mutácie menia vlastnosti vírusu
Niet pochýb o tom, že SARS-CoV-2 začína v niektorých geografických regiónoch rýchlejšie mutovať. Nepríjemné je, že je to práve v S proteíne ktorý je zodpovedný prostredníctvom RBD za väzbu vírusu s bunkou a za imunitnú odpoveď organizmu na vírusovú infekciu. Časť mutácií je neškodná, iné môžu zmeniť jeho vlastnosti.
Mutácie zatiaľ spôsobili, že niektoré vírusové varianty získali evolučnú výhodu – sú infekčnejšie, to znamená, že infikujú viac ľudí a pri variante z Británie aj viac aj ľudí mladších ako 60 rokov a deti. Vyššia infekčnosť zmutovaných vírusových variantov má ďalší nepríjemný sprievodný dopad na ľudskú populáciu. Časť zvýšeného počtu infikovaných pacientov vyžaduje hospitalizáciu a tým sa preťažuje nemocničný systém. Lekári zatiaľ neindikujú, že by nové vírusové varianty spôsobovali ťažší priebeh infekcie.
Ako vznikajú doteraz nepoznané varianty SARS-CoV-2? Jedným z vysvetlení je, že pacienti s vysokou dávkou vírusu alebo chronickí pacienti sú niekedy liečení podaním séra s protilátkami proti SARS-CoV-2 od pacientov, ktorí už COVID-19 prekonali.
Ukazuje sa, že v takom prípade je v genóme vírusu pozorovaných viac mutácií, prípadne delécii v dôsledku protilátkami sprostredkovaného selekčného tlaku. Vtedy dochádza k rýchlej fixácii genetických zmien vo vírusovom genóme a tým k vzniku nových vírusových variantov. V iných prípadoch vírus infikuje zvieratá, čím vznikajú nové mutácie (viď prípad infikovaných noriek s mutáciou Y453F a deléciou 69-70deltaHV) s následnou infekciou ľudí.
Ani jedna z mutácií neovplyvňuje kvalitu väčšiny diagnostických PCR testov. Tieto testy sú zvyčajne zamerané na detekciu dvoch nezávislých oblastí vírusového genómu, spravidla tých, ktoré nekódujú S proteín. Takže aj keby došlo k mutácii v jednej z inkriminovaných oblastí genómu, ďalšia postačuje, aby PCR test detegoval vírus.
Niektoré vírusové varianty s mutovanými aminokyselinami v oblasti RBD vykazujú o niečo slabšiu väzbu s protilátkami, čo by mohlo mať vplyv na terapeutické využitie monoklonálnych protilátok, ale či to indikuje aj ovplyvnenie účinnosti vakcín, zatiaľ presne nevieme. Väčšina dnešných vakcín je namierených na viaceré časti S proteínu, takže doterajšie mutácie pravdepodobne nemajú podstatný vplyv na ich účinnosť.
Skratky aminokyselín: A – alanín, D – kyselina asparagová, E – kyselina glutamová, F – fenylalanín, G – glycín, H – histidín, I – izoleucín, K – lyzín, L – leucín, N – asparagín, P – prolín, R – arginín, S – serín, T – treonín, V – valín, Y – tyrozín
Prof. Ing. Štefan Vilček, DrSc.
(vedecký pracovník Katedry infektológie, parazitológie a ochrany spoločného zdravia na Univerzite veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach)
