V podmienkach stresu, akými môže byť napr. fyzické cvičenie či emočný stres, sa v krvi zvyšuje hladina katecholamínov. To vedie k stimulácii receptorov lokalizovaných na povrchovej membráne srdcovej svalovej bunky. Práve aktivovanie týchto receptorov spúšťa v srdcovej bunke celú kaskádu fosforylačných procesov. Tie priamo zasahujú aj objekt záujmu riešiteľov projektu Regulácia srdcového ryanodínového receptora fosforylovaného proteín kinázou A a tým je ryanodínový receptor (RYR2).
„RYR2 kanál je Ca2+ iónový kanál zohrávajúci nezastupiteľnú úlohu v kontrakčnej mašinérii srdcovej bunky, pretože z vnútrobunkového zásobníka uvoľňuje ióny Ca2+, ktoré sú nevyhnutné na aktiváciu kontraktilného systému, čo vedie ku kontrakcii/stiahnutiu srdcovej bunky. Pri fosforylácii RYR2 kanála zohráva dôležitú úlohu proteín kináza A (PKA). Dnes už vieme, že miesta určené na fosforyláciu sú lokalizované na flexibilnej slučke fosforylačnej domény, ktorá sa pri činnosti RYR2 kanála, čiže jeho otváraní a zatváraní, podstatne hýbe. To znamená, že funkcia kanála môže byť efektívne ovplyvnená procesom fosforylácie,“ uviedla zodpovedná riešiteľka Mgr. Jana Gaburjáková, PhD., Centrum biovied SAV.
Aj keď sa viaceré experimentálne štúdie podľa nej pokúšali ohodnotiť vplyv PKA fosforylácie priamo na reguláciu RYR2 kanála, naďalej vedcom chýba jasný obraz o tom, ktoré vlastnosti kanála sa PKA fosforyláciou menia. Dôvodom takéhoto stavu je značná heterogenita v doterajších experimentálnych výsledkoch.
„Príčinu takejto heterogenity možno hľadať hlavne v spôsobe vyvolania a následnej detekcie stavu fosforylácie RYR2 kanála, čo sa ukazuje ako nie triviálny problém.“
Hlavným cieľom projektu je komplexnejšie zhodnotiť efekt fosforylácie RYR2 kanála na funkčnej úrovni. Zodpovedná riešiteľka vysvetľuje:
„Použijeme rôzne experimentálne prístupy, ale tým hlavným a typickým pre nás je experimentálna metóda, pri ktorej prenesieme iónový kanál z jeho prirodzeného prostredia biologickej membrány do náhradného systému – umelej lipidovej membrány, kde iónový kanál môže naďalej dobre fungovať. Táto metóda nám umožňuje testovať vlastnosti iónového kanála v rôznych experimentálnych podmienkach.“
Na detekciu celkového stavu fosforylácie RYR2 kanála vedci zvolili modernejší prístup bez použitia rádioaktívne značeného [32P]ATP. „Tento novší prístup je založený na interakcii špeciálne pripravenej molekuly Phos-tag Biotin, ktorý rozpoznáva na proteíne jeho fosforylované miesta. Túto metodiku sme už zaviedli v našom laboratóriu. Ďalej sme sa naučili ako vynútiť fosforyláciu iba aktiváciou PKA kinázy, ktorá je priamo ukotvená na RYR2 kanáli. Teraz prebiehajú funkčné experimenty, čiže skúmame, ako PKA fosforylácia modifikuje vlastnosti RYR2 kanála, pričom skúmame kanál v takmer fyziologických podmienkach, čo sa týka kompozície prostredia na oboch stranách kanála. Po ukončení experimentálnej časti sa budeme venovať vyhodnocovaniu získaných záznamov a projekt uzavrieme preskúmaním fosforylácie RYR2 kanála využitím bioinformatických nástrojov.“
Ako ešte približuje Mgr. Jana Gaburjáková, PhD., fosforylácia sa zaraďuje k reverzibilným posttranslačným modifikáciám proteínov, a teda proces je fyziologický.
„Keď sa ale naruší rovnováha medzi fosforyláciou a defosforyláciou proteínov, môže nastať napr. stav chronicky pretrvávajúcej fosforylácie, čo už môže byť patologické. A práve v prípade RYR2 kanála sa preukázala priama súvislosť s jeho pretrvávajúcou fosforyláciou a chronickým srdcovým zlyhávaním, keď srdce nedostatočne pumpuje krv do celého tela. Počet prípadov tohto ochorenia neustále narastá aj na Slovensku. Pokiaľ by sme pochopili fosforyláciu RYR2 kanála komplexnejšie, čiže ako sa mení funkčný profil fosforylovaného kanála, tak by sme mohli efektívnejšie navrhovať a aj testovať potenciálne liečivá, ktoré by mohli kompenzovať patologický účinok predĺženej fosforylácie bez nutnosti zasahovať do fosforylačnej rovnováhy v bunke, ktorá sa týka aj iných proteínov, nielen RYR2 kanála.“
Riešiteľský kolektív:
Projekt je finančne podporený vedeckou grantovou agentúrou VEGA (No:2/0011/18, 2018 – 2020) a komplexne sa rieši na našom pracovisku v Centre biovied SAV (Bratislava) na Oddelení biofyziky a elektrofyziológie. Riešiteľský tím zahŕňa dvoch vedeckých pracovníkov: Mgr. Jana Gaburjáková, PhD. (vedúca projektu) a Mgr. Marta Gaburjáková, PhD. Ďalej v tíme pracuje výskumný pracovník RNDr. Eva Krejčíová a taktiež laborantka Ľubica Máleková. Do riešiteľského tímu sú operatívne začleňovaní aj bakalárski študenti a diplomanti.
Odborný garant textu: Mgr. Jana Gaburjáková, PhD., Centrum biovied SAV
Spracovala: Slávka Cigáňová (Habrmanová), NCP VaT pri CVTI SR
Ilustračné foto: Pixabay.com /Pexels/
Uverejnila: VČ