Študentská osobnosť Slovenska Peter Pôbiš: Rekonštituované 3D modely z ľudských buniek ako súčasť modernej toxikológie

Mladý vedec sa zaoberá vývojom postupov na hodnotenie bezpečnosti zdravotníckych pomôcok.

Peter Pôbiš pôsobí v Ústave experimentálnej farmakológie a toxikológie Centra experimentálnej medicíny Slovenskej akadémie vied, v. v. i., ako člen tímu SK-NETVAL. Vo svojej práci sa zameriava na využitie moderných in vitro 3D modelov ľudských tkanív v toxikológii, ktoré pomáhajú rozvíjať presnejšie a etickejšie prístupy k hodnoteniu bezpečnosti zdravotníckych pomôcok, farmaceutík a chemických látok.

Venuje sa práci s rekonštituovanými modelmi kože, rohovky, ústnej sliznice, dýchacích ciest a čreva. Počas svojho výskumu sa podieľal aj na rozvoji metodických prístupov na hodnotenie očnej iritácie a fotoiritácie s využitím modelu EpiOcular™.

Za svoje doterajšie výsledky získal viacero ocenení, medzi nimi aj titul Študentská osobnosť akademického roka 2024/2025 v kategórii farmácia. Okrem vedeckej práce sa zapája aj do popularizácie vedy, vedenia diplomových prác a spoluorganizácie odborných podujatí.

Čo si možno predstaviť pod pojmom 3D rekonštituovaný tkanivový model?

Zjednodušene povedané, ide o laboratórne pripravené tkanivo z ľudských buniek, ktoré sa svojou štruktúrou a správaním v mnohom podobá skutočnému ľudskému tkanivu. Označenie 3D znamená, že bunky nie sú kultivované len v jednej vrstve, ale vytvárajú priestorovú štruktúru, ktorá lepšie napodobňuje reálne podmienky v organizme.

Takéto modely sú veľmi užitočné, pretože nám umožňujú presnejšie skúmať, ako tkanivo reaguje na rôzne látky alebo materiály. Zároveň predstavujú jednu z možností, ako v niektorých typoch testovania obmedziť používanie laboratórnych zvierat.

Čo vás viedlo k výskumu 3D rekonštituovaných tkanivových modelov?

K výskumu 3D rekonštituovaných tkanivových modelov som sa dostal počas vysokoškolského štúdia na Fakulte chemickej a potravinárskej technológie Slovenskej technickej univerzity, keď som už vo štvrtom ročníku začal pracovať v Slovenskej akadémii vied. Táto téma sa stala súčasťou mojej diplomovej práce a postupne ma zaujala natoľko, že som sa jej venoval aj ďalej.

Oslovilo ma najmä to, že ide o modernú a perspektívnu oblasť, ktorá spája základný výskum s praktickým využitím. Tieto 3D rekonštituované modely tkanív nachádzajú uplatnenie pri hodnotení bezpečnosti rôznych látok, materiálov či zdravotníckych pomôcok a zároveň predstavujú jednu z ciest, ako v niektorých prípadoch obmedziť testovanie na laboratórnych zvieratách.

Zaujímavé pre mňa je aj to, že ide o odbor, ktorý sa stále intenzívne rozvíja. Nové prístupy, ako napríklad organ-on-chip technológie, ukazujú, že možnosti in vitro modelov sa budú v budúcnosti ďalej rozširovať.

Skúmate fototoxicitu. Čo tento jav predstavuje?

Fototoxicita je nežiaduci jav, pri ktorom niektoré látky po vystavení svetlu, najmä UV žiareniu, môžu vyvolať poškodenie buniek alebo tkanív. Za bežných podmienok pritom nemusia pôsobiť dráždivo ani toxicky, problém sa môže objaviť až po ich aktivácii svetlom.

Súvisí to s tým, že pri takomto procese vznikajú reaktívne molekuly, napríklad voľné radikály, ktoré narúšajú bunkové štruktúry. Výsledkom môže byť podráždenie alebo iné nežiaduce účinky v mieste kontaktu.

Testovali ste 3D model EpiOcular™, ktorý je určený na otestovanie očného podráždenia a fototoxicity. Ako tento model funguje?

EpiOcular™ je laboratórne pripravený 3D model ľudskej rohovky, ktorý sa využíva na hodnotenie očného podráždenia a fototoxicity. Je vytvorený z ľudských kožných buniek (keratinocytov) a má viacvrstvovú štruktúru, ktorá v mnohých ohľadoch napodobňuje vlastnosti povrchu oka. V porovnaní s kožou nemá zrohovatenú vrstvu a je teda oveľa citlivejší ako ľudská pokožka.

Napriek tomu, že je pripravená z kožných buniek, zachováva si dôležité charakteristiky ľudskej rohovky, ako sú bariérová funkcia, životaschopnosť buniek či schopnosť reagovať na chemické podnety. Vďaka tomu je možné sledovať reakciu tkaniva na testovanú látku alebo materiál a posúdiť ich potenciálny dráždivý alebo fototoxický účinok.

Akým spôsobom ste testovali fototoxicitu na tomto modeli?

Pri testovaní fototoxicity aplikujeme skúmanú látku, produkt alebo extrakt z materiálu na 3D tkanivový model. Následne časť tkanív vystavíme žiareniu, ktoré napodobňuje slnečné svetlo, zatiaľ čo druhá časť zostáva neožiarená ako kontrola. Potom porovnávame ich životaschopnosť a sledujeme, či ožiarenie v prítomnosti testovanej látky vedie k väčšiemu poškodeniu tkaniva. Pri nastavovaní tohto postupu sme sa inšpirovali protokolom, ktorý je už validovaný v rámci OECD pre testovanie kožnej dráždivosti, a jeho princíp sme prispôsobili podmienkam hodnotenia fototoxicity na očnom modeli. Ak je rozdiel medzi ožiarenými a neožiarenými tkanivami výrazný (25 % a viac), v danej koncentrácii považujeme látku za potenciálne fototoxickú.

Umožňuje tento model určiť aj to, ako veľmi je látka fototoxická ?

Ak látku testujeme vo viacerých koncentráciách, vieme lepšie odhadnúť jej fototoxický potenciál. Zjednodušene povedané, látky, pri ktorých sa fototoxický efekt objaví už pri nižších koncentráciách, môžu predstavovať vyššie riziko. Práve pri takomto type hodnotenia sú 3D modely kože alebo rohovky veľmi užitočné, pretože umožňujú testovať účinok rôznych koncentrácií v kontrolovaných a reprodukovateľných podmienkach.

Aké zdravotnícke očné pomôcky môžeme testovať na tomto modeli?

Na tomto modeli je možné testovať rôzne typy očných zdravotníckych pomôcok – od očných roztokov a gélov až po niektoré tuhé materiály. Pri tuhých materiáloch sa často hodnotia ich extrakty, teda látky, ktoré sa z materiálu môžu uvoľňovať. Model EpiOcular™ však vďaka svojej štruktúre umožňuje v určitých prípadoch sledovať aj priame kontaktné pôsobenie materiálu na tkanivo, čo rozširuje možnosti jeho využitia pri hodnotení bezpečnosti.

Akým spôsobom sa na takýchto modeloch testujú šošovky či očné roztoky?

Postupy testovania zdravotníckych pomôcok vychádzajú zo súboru medzinárodných noriem ISO 10993 a v Európskej únii ich regulačný rámec dopĺňa nariadenie MDR. V oblasti hodnotenia očnej dráždivosti zdravotníckych pomôcok zatiaľ nie sú k dispozícii validované alternatívne metódy, hoci ISO už pripúšťa aj použitie 3D modelov. Ich širšie uplatnenie je však podmienené riadnou validáciou.

V našom prípade sme preto vychádzali z existujúceho a v ISO implementovaného testu vyvinutého pre kožný epitel, ktorý sme upravili tak, aby bol použiteľný aj pre model rohovkového epitelu.

Pri očných roztokoch testujeme buď priamo finálny produkt, ale je možné testovať aj jednotlivé zložky. Pri šošovkách alebo všeobecne pri polyméroch a iných tuhých nerozpustných látkach sa zvyčajne testujú ich extrakty.  Extrakty pripravujeme v súlade s ISO štandardom, a to vložením napríklad uvedenej šošovky do polárneho a nepolárneho extrakčného činidla, v tomto prípade je to fyziologický roztok a sezamový olej. Následne tieto šošovky extrahujeme v roztoku 24 – 72 hodín vo vodnom kúpeli. Takto pripravené extrakty potom aplikujeme na rohovkový epitel, necháme ich pôsobiť 21 hodín, pričom sledujeme zmenu životaschopnosti buniek tkaniva a tiež môžeme stanovovať napríklad zápalové markery uvoľnené do kultivačného média.

Na modeli ste testovali aj implantovateľné kontaktné šošovky. Čo ste zistili?

Pri implantovateľných kontaktných šošovkách sme nehodnotili len ich extrakty, ale využili sme aj možnosť priameho kontaktu šošovky s 3D tkanivovým modelom. To nám umožnilo sledovať aj situáciu, keď materiál pôsobí priamo na povrch tkaniva. Išlo len o takzvanú potvrdzujúcu štúdiu, ktorá nám však priniesla zaujímavý výsledok.

Počas hodnotenia fotoiritačného potenciálu sme po ožiarení zaznamenali lokálny pokles životaschopnosti buniek v centrálnej oblasti pod šošovkou. Pravdepodobne to súviselo s optickými vlastnosťami šošovky a so spôsobom, ako ovplyvnila dopad svetla na tkanivo. Tento výsledok nám pomohol lepšie pochopiť limity modelu a ukázal, aké dôležité je správne nastavenie protokolu aj interpretácia dát.

Dokáže tento model predpovedať napríklad aj zápal či podráždenie očí?

Naša štúdia ukázala, že tento model spolu s navrhnutým protokolom má potenciál predpovedať podráždenie oka po jednorazovom vystavení testovanej látke. Zatiaľ však ide o výskumný prístup, ktorý je ešte potrebné validovať, teda overiť jeho spoľahlivosť a reprodukovateľnosť aj medzi viacerými laboratóriami.

Keďže ide o nevaskularizovaný model, nevieme na ňom sledovať niektoré typické prejavy podráždenia alebo zápalu, ako sú napríklad začervenanie či opuch. Hodnotíme preto najmä nepriame ukazovatele účinku testovanej látky, ako je životaschopnosť tkaniva alebo vybrané markery včasnej bunkovej odpovede. Tieto údaje nám môžu poskytnúť užitočnú doplnkovú informáciu, no stále nejde o plnohodnotný obraz komplexnej reakcie oka v živom organizme.

Našli ste nejaké iné očné zdravotnícke pomôcky, ktoré znižovali životaschopnosť tkaniva a nemuseli byť vhodné pre každého pacienta?

Nenašli sme zdravotnícke pomôcky určené pre oko, ktoré by v našom modeli vykazovali taký účinok, že by ich bolo možné považovať za nevhodné pre pacientov. Pracovali sme najmä s komerčne dostupnými produktmi, ktoré už prešli hodnotením bezpečnosti, a preto sa pri nich výrazná toxicita ani neočakáva.

Zároveň sme však pri niektorých prípravkoch zaznamenali mierny pokles životaschopnosti tkaniva. Išlo pritom o produkty, pri ktorých aj samotný výrobca uvádza možnosť mierneho podráždenia, najmä u citlivejších osôb. Boli to antiseptické kvapky. Naše výsledky preto nenaznačujú, že by tieto výrobky boli nebezpečné, ale skôr ukazujú, že použitý protokol v kombinácii s 3D modelom dokáže zachytiť aj jemnejšie dráždivé účinky.

Existujú na trhu modely s podobnými alebo lepšími vlastnosťami ako EpiOcular™?

Na trhu existujú aj ďalšie 3D modely rohovkového epitelu, nielen EpiOcular™, ktorého výroba prebieha v USA a na Slovensku. Aj to je dôvod, prečo tento model používame v našich laboratóriách a sme hrdí, že sa na jeho výrobe a validácii podieľa aj Slovensko. Medzi ďalšie známe komerčne dostupné modely patria systémy od spoločností pôsobiacich vo Francúzsku, v Japonsku a Južnej Kórei, ktoré sa využívajú vo výskume aj v regulačne relevantných testovacích prístupoch. Nedá sa však všeobecne povedať, že niektorý z nich je lepší, pretože ich vhodnosť závisí od konkrétnej aplikácie, typu hodnotenia a úrovne validácie.

Popri komerčných modeloch existujú aj laboratórne systémy vyvíjané na univerzitách a vo výskumných inštitúciách, napríklad Hemicornea alebo ďalšie experimentálne modely vrátane ex vivo očných systémov, ako sú napríklad bovinná alebo kuracia rohovka. Tieto prístupy môžu byť z vedeckého hľadiska veľmi zaujímavé, no zvyčajne nie sú bežne komerčne dostupné, a preto sa zatiaľ nevyužívajú tak široko ako etablované komerčné modely. Ja osobne mám skúsenosť najmä s modelom EpiOcular™, preto by som bol pri detailnom porovnávaní iných systémov opatrný.

Prečo je dôležité komunikovať výsledky výskumu verejnosti? Akými spôsobmi sa snažíte popularizovať svoj výskum?

Komunikovať výsledky výskumu verejnosti je dôležité preto, lebo veda by nemala zostať uzavretá len v laboratóriách alebo odborných časopisoch. Mnohé témy, ktorým sa venujeme, sa priamo dotýkajú zdravia, bezpečnosti či kvality života, a preto má zmysel vysvetľovať ich zrozumiteľne aj širšej verejnosti.

Na Ústave experimentálnej farmakológie a toxikológie aj v rámci Centra experimentálnej medicíny SAV sa zapájame do rôznych popularizačných podujatí, ako sú napríklad Noc vedy, dni otvorených dverí či Víkend so SAV. Na týchto akciách sa snažíme priblížiť ľuďom, čomu sa vo výskume venujeme a prečo je to dôležité. Osobne sa do týchto aktivít zapájam spolu s kolegami a pomáham aj s ich organizáciou. Okrem toho komunikujeme naše výsledky a zaujímavé témy aj cez sociálne siete a príležitostne aj prostredníctvom médií. Dôležitú úlohu v popularizácii zohráva aj naša medzinárodná spolupráca, napríklad v rámci projektu ONTOX, alebo zapojenie sa do networkingových skupín mladých vedeckých pracovníkov v rámci organizácií EUROTOX a ESTIV, ktorých som členom.

Čo je náplňou  projektu ONTOX?

Ide o medzinárodný projekt financovaný z programu Horizont 2020, ktorého cieľom je vývoj inovatívnych prístupov na hodnotenie rizika chemických látok. Tieto metodiky kombinujú experimentálne (najmä in vitro) a výpočtové prístupy vrátane umelej inteligencie a sú zamerané najmä na hodnotenie účinkov opakovanej expozície na pečeň, obličky a vývoj nervového systému.

Projekt spája partnerov z viacerých krajín Európy aj zo zahraničia a zároveň je súčasťou širšieho klastra ASPIS, ktorý prepája tri príbuzné európske projekty zamerané na nové prístupy v hodnotení rizika. V rámci ASPIS sa zapájam aj do aktivít ASPIS Academy, ktorá sa venuje podpore a rozvoju mladých vedcov. Pre mňa osobne je účasť v takomto projekte cenná najmä tým, že prináša možnosť medzinárodnej spolupráce, výmeny skúseností a zároveň aj príležitosť zviditeľňovať slovenský výskum v širšom, európskom priestore.

Aké máte ďalšie plány v oblasti výskumu?

Do budúcnosti by som sa chcel ďalej venovať 3D tkanivovým modelom a ich využitiu pri hodnotení bezpečnosti zdravotníckych pomôcok, chemických látok a farmaceutík. Zaujíma ma aj vývoj a optimalizácia špecializovaných protokolov, ktoré by mohli prispieť k širšiemu uplatneniu týchto prístupov v praxi. Veľmi ma zaujímajú aj nové technológie, najmä mikrofluidické systémy, ako sú organ-on-chip alebo human-on-chip modely, ktoré predstavujú perspektívny smer vývoja in vitro metód. Zároveň by som sa chcel ďalej rozvíjať aj v dátovej analýze a programovaní, napríklad v jazyku Python, aby som tieto zručnosti vedel lepšie využiť vo svojom výskume. Do budúcnosti by som tiež rád absolvoval zahraničnú stáž, kde by som získal nové skúsenosti, naučil sa nové metodiky a nadviazal odborné kontakty.

(RR)