Fenylketonúria patrí medzi dedičné metabolické poruchy charakterizované nedostatočným metabolizmom aminokyselín. Jedinci postihnutí týmto ochorením nedokážu spracovať aminokyselinu fenylalanín (PHE), čím nastáva nahromadenie PHE v organizme. Patologicky zvýšená koncentrácia PHE v organizme má za následok ťažké, nezvratné, degeneratívne poškodenie buniek centrálnej nervovej sústavy. Konštatovali to autori Martina Micháliková, Martina Machková a Svetlana Hrouzková, Ústav analytickej chémie, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave vo svojej práci Optimalizácia podmienok tandemovej hmotnostnej spektrometrie (ms/ms) pre stanovenie fenylalanínu.
Práve z tohto dôvodu je podľa nich potrebné ochorenie diagnostikovať už v prvých dňoch života dieťaťa. „Včasný záchyt ochorenia skríningom umožní zahájiť účinnú liečbu ešte pred poškodením buniek, čím je možné zamedziť postupu degenerácie. Novorodenecký skríning na Slovensku je štátny preventívny program, ktorý celoplošne vyhľadáva pri všetkých novorodencoch vrodené a dedičné poruchy vrátane fenylketonúrie. Detekcia vybraných aminokyselín a acylkarnitínov sa najčastejšie v novorodeneckom skríningu realizuje metódou tandemovej hmotnostnej spektrometrie (MS/MS), v móde snímania iónov ´multiple reaction monitoring´ (MRM).“
Cieľom tejto práce bolo optimalizovať vybrané parametre tandemového hmotnostného spektrometra pre stanovenie fenylalanínu vo vzorke suchej kvapky krvi novorodencov.
Autori uvádzajú, že odber vzorky krvi pre novorodenecký skríning sa vykonáva z prekrvenej pätičky novorodenca na špeciálny odberový papierik, na ktorom sa odberom vytvorí krvná škvrna, čím vznikne tzv. suchá kvapka krvi. „Zo vzorky suchej kvapky krvi sa vyštikne terčík o presne definovanom priemere a umiestni sa do pozície v mikrotitračnej platničke s filtrom. Prvým krokom prípravy vzorky je extrakcia analytov z krvného terčíka. Pre odstránenie terčíka a hrubých papierových nečistôt, vzniknutých pri vyštikávaní vzoriek, sa využila centrifugácia. V procese centrifugácie je extrakt oddelený od terčíku a následne prenesený z mikrotitračnej platničky s filtrom do druhej platničky so zachovaním pozícií jednotlivých vzoriek. Nasledujúcim krokom je odparenie extrakčného činidla. Po kompletnom vysušení vzoriek sa pridalo derivatizačné činidlo.“
Kolektív autoriek pokračuje, že cieľom derivatizácie je zvýšiť selektivitu a špecificitu stanovenia, výsledkom derivatizačnej reakcie je vznik butylesterov jednotlivých aminokyselín a acylkarnitínov. „Po derivatizácii je nutné odpariť zvyšok činidla prúdom vzduchu. Posledným krokom prípravy vzorky bola rekonštitúcia vzorky roztokom so zložením podobným mobilnej fáze. Pre detekciu fenylalanínu sa použil kvapalinový chromatograf Agilent 1260 infinity LC systém v spojení s hmotnostným spektrometrom s trojitým kvadrupólovým analyzátorom Agilent 6420 v usporiadaní s odplyňovačom mobilnej fázy, autosamplerom, binárnym čerpadlom, bez použitia separačnej kolóny a s elektrosprejovou ionizáciou. Zber údajov sa realizoval pomocou softvéru MassHunter.“
Trio autoriek tvrdí, že pre novorodenecký skríning tandemová MS najčastejšie pozostáva z dvoch analyzátorov hmotnosti spojených kolíznou celou. Vysvetľujú, že kolízna cela poskytuje priestor na fragmentáciu a tranzit vybraných iónov analytu. „Ionizácia analytov je zvyčajne realizovaná elektrosprejovou ionizáciou, pri ktorej efluent vzorky prechádza kapilárou, na ktorú je vkladané vysoké napätie. Vytvorené ióny vchádzajú do prvého analyzátora hmotnosti, kde sa vyberie prekurzorový ión. Ten sa v kolíznej cele štiepi a vyberie sa produktový ión, ktorý sa sleduje v druhom analyzátore. Z reakcií prekurzorových iónov a produktových iónov, tzv. tranzitných reakcií, sa zostavuje metóda MRM. Na voľbu prekurzorového iónu sa použil softvér pre hľadanie distribúcie izotopov a nájdené hodnoty sa použili ako počiatočné pre následné hľadanie hodnoty m/z produktového iónu.“
Pri hľadaní produktového iónu autorky práce aplikovali postupnú zmenu kolíznej energie a sledovali zmenu m/z v získanom spektre pri rôznej kolíznej energii. Po zistení kompletného obrazu o m/z hodnotách prekurzora a produktu začali s optimalizáciou MRM metódy pre fenylalanín. Vyhľadali vhodné parametre fragmentora a kolíznej energie. Následne študovali vplyv času sledovania prechodu „dwell time“ na tvar zaznamenaného píku. Po vytvorení MRM autorky sledovali vplyv tlaku nebulizéra na sledovaný analyt a vybrali optimálnu hodnotu. Pre overenie analytickej metódy vytvorenú metódu aplikovali na analýzu vzorky pacienta s fenylketonúriou a porovnali výsledné koncentrácie PHE s výsledkami získanými rutinnou metódou používanou v laboratóriu Skríningového centra novorodencov SR pre zistenie koncentrácie fenylalanínu.
„Podmienky tandemovej hmotnostnej spektrometrie MS/MS pre sledovanie koncentrácie fenylalanínu bez predchádzajúcej chromatografickej separácie sa optimalizovali a metóda sa aplikovala na analýzu reálnej vzorky krvi pacienta s fenylketonúriou,“ konštatovali autorky v závere.
Príspevok vyšiel v zborníku celoslovenskej Študentskej vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou s názvom Chémia a technológie pre život, organizovanej v priestoroch Fakulty chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave dňa 7. 11. 2018, pričom išlo o okrúhly, 20. ročník.
Študentská vedecká konferencia sa konala v odbore chémia a chemická a potravinárska technológia. Išlo o príležitosť pre študentov 1. stupňa (bakalárskeho) a 2. stupňa (inžinierskeho) vysokoškolského štúdia súťažne prezentovať vedecké a odborné práce. Najlepšie práce v jednotlivých sekciách boli odmenené.
Spracovala: Slávka Cigáňová (Habrmanová), NCP VaT pri CVTI SR
Zdroj informácií: https://www.uiam.sk/svk/
Ilustračné foto: Pixabay.com /Aafke/
Uverejnila: VČ