Rastliny rastúce voľne v prírode ľudia po mnoho tisícročí využívali ako potravu, na liečenie, ale aj na ďalšie spracovanie. Rôznymi postupmi sa snažili zlepšiť ich kvalitu a vlastnosti. Dnešné moderné rastlinné biotechnológie sú vedou 3. tisícročia a dokážu upravovať rastliny doslova na mieru.
Ak použijeme správnu rastovú látku v správnej koncentrácii, dosiahneme tvorbu orgánu, ktorý chceme v rastlinnej kultúre vyvolať.
V praxi je možné využiť techniky pletivových kultúr na namnoženie cenného rastlinného materiálu, a získať tak rastliny navlas rovnaké ako rodičovská rastlina, alebo v nich indukovať aj nové vlastnosti.
Spočiatku si ľudia iba všímali divorastúce rastliny a vyberali z nich tie najkvalitnejšie, najkrajšie, najsladšie alebo najväčšie. Robili z nich výber. Z takýchto rastlín si odložili semená a z nich pestovali ďalšie rastliny. Neskôr si všimli, že kvalitu rastlín a ich vlastnosti možno meniť aj krížením, čo prinieslo ďalšie možnosti vylepšovania. Naučili sa rastliny rozmnožovať a ďalej skvalitňovať.
Množenie rastlín
Už na základnej škole sme sa učili, že rastliny sa množia pomocou odrezkov, hľúz, cibuľkami, delením trsov a podobne, vtedy hovoríme o vegetatívnom množení. Množenie semenami sa nazýva generatívne množenie. Existujú však aj iné metódy rozmnožovania?
Nové možnosti pestovania rastlín
Dnes veda, ale čiastočne už aj prax, disponujú modernými metódami prípravy rastlín na mieru (tzv. rastliny pre budúcnosť). Moderné prístupy sa opierajú o poznatok, že bunky rastlín, ktoré obsahujú jadro (všetky bunky okrem buniek ciev) sú totipotentné, teda schopné za špecifických podmienok reprodukovať celý nový rastlinný organizmus. Na tomto poznatku sa zakladá celá jedna oblasť rastlinných biotechnológií – pletivové kultúry. Aby sme pletivové kultúry získali, potrebujeme časť pletiva odobratého z materskej rastliny, ktoré potom pestujeme v laboratórnych podmienkach v skúmavke alebo iných sklených či plastových nádobách (in vitro – v latinčine znamená v skle). Veľmi dôležitým momentom pri tejto práci je dodržanie sterilných podmienok. Práce s vopred vysterilizovaným rastlinným materiálom sa robia v boxoch, v ktorých proti pracovníkovi prúdi sterilný vzduch a všetky nástroje a roztoky sa tiež sterilizujú. Poznáme niekoľko typov takýchto kultúr rastlinných pletív.
Z rastliny môžeme odobrať kúsok listu a vyrezať z neho úsek približne 1 cm2 a ten umiestniť na tzv. kultivačné médium v spomínaných nádobách. Kultivačné médium obsahuje látky potrebné pre výživu rastlinného pletiva (minerálne látky, nejaký cukor ako zdroj energie, vitamíny a látky, ktoré regulujú rast). Okrem toho sa ešte obyčajne použije látka, ktorá spevní takto pripravené kultivačné médium (agar alebo želatína). Poranené bunky na tomto kúsku listu sa začnú deliť a okolo pletiva sa po určitom čase vytvorí kalus, akési hojivé pletivo. V priebehu 3 až 4 týždňov sa bunky v kaluse namnožia a pritom spotrebujú značnú časť výživy z kultivačného média. Súčasne aj produkujú splodiny svojho metabolizmu späť do média. Preto takéto kalusy musíme prenášať v určitých časových intervaloch (21 až 28 dní) na čerstvé kultivačné médium. Pritom sa neprenáša celý kalus, ale ten sa obyčajne rozdelí na menšie úseky a všetky takto získané úseky prenesieme na čerstvé médium. Týmto spôsobom zároveň ten rastlinný materiál rozmnožíme. Z neho potom môžeme extrahovať rôzne biologicky aktívne látky (silice, éterické oleje, polyfenoly) pre využitie napríklad vo farmaceutickom priemysle či potravinárstve.
Okrem toho, ak takéto zhluky buniek rozotrieme alebo roztrepeme v tekutom kultivačnom médiu (bez agaru), vytvoríme suspenziu jednotlivých buniek alebo ich malých zhlukov. Získame tzv. suspenzné kultúry. Ich zvláštnosťou je, že ich musíme pestovať na trepačkách, špeciálnych prístrojoch, ktoré nepretržite pretrepávajú obsah suspenzie. Aby bunky ponorené v tekutine nerušene rástli a vyvíjali sa, potrebujú neustále prevzdušňovanie, dostatok kyslíka, ale aj rovnomerný prístup k rozpusteným výživným látkam. To je úlohou trepačky. Suspenzné kultúry môžeme pestovať aj v bioreaktoroch, kde získavame bioaktívne látky vo veľkom množstve.
Rastlinné bunky pestované v podmienkach in vitro môžeme aj zbaviť bunkovej steny. Dosiahneme to pomocou enzýmov, ktoré rozkladajú celulózu a hemicelulózu (hlavné komponenty bunkových stien rastlín). Získame takto tzv. protoplasty.
Nahé bunky
Načo potrebujeme nahé bunky? Bunky zbavené bunkových stien možno pestovať ako protoplastové kultúry pri dodržaní istých prísnych kultivačných a sterilných podmienok. Takýmto spôsobom dokážeme prinútiť splynúť aj bunky takých rastlín, ktoré by sa v prírode nikdy prirodzene neskrížili.. Využívame na to chemikáliu polyetylénglykol alebo slabý elektrický impulz. Výsledkom je bunka, v ktorej za ideálnych okolností splynú cytoplazmy i jadrá oboch pôvodných buniek. Táto nová bunka si v priebehu približne 24 hodín vytvorí novú bunkovú stenu, začne sa deliť a vytvorí kalus. Z kalusu môžeme potom získať rastlinu s úplne novými vlastnosťami.
Potrebujete výhonok?
S kalusom získaným niektorým z popísaných postupov môžeme pracovať ďalej. Niekedy je potrebné, aby sme získali nové kompletné rastliny, ktoré budú mať koreň, stonku a listy. To znamená, že potrebujeme navodiť v kultúre in vitro podmienky na regeneráciu novej rastliny. Potom nastupujú na scénu tzv. rastové regulátory, ktoré aplikujeme do kultivačného média. Rastové regulátory sú látky, ktoré sa vytvárajú aj v prirodzených podmienkach v každej rastline a riadia v nej všetky procesy rastu a vývinu. Poznáme niekoľko skupín takýchto regulátorov rastu a vedci už vedia, ktorá rastová látka aký proces v rastline riadi. Veľmi efektívne sa to využíva pri práci s pletivovými kultúrami rastlín. Tvorbu nových orgánov v kultúre in vitro nazývame morfogenéza. Ak použijeme správnu rastovú látku v správnej koncentrácii, dosiahneme tvorbu orgánu, ktorý chceme v kultúre vyvolať. Napríklad tvorbu výhonkov môžeme podporiť pridaním cytokinínov do kultivačného média. Ak chceme podporiť tvorbu koreňov, pridáme rastovú látku zo skupiny hormónov auxínov. Rovnako budeme postupovať, ak budeme chcieť výhonky vytvorené na kultivačnom médiu s cytokinínmi zakoreniť. Vtedy prenesieme vytvorené výhonky na kultivačné médium obohatené auxínmi. Tak získame plne vyvinuté rastlinky, ktoré možno presadiť do pôdy.
Sadenie
Prenos nových rastliniek do pôdy by sme mohli zjednodušenie nazvať sadením. Musíme to však urobiť veľmi opatrne. Osvedčilo sa preniesť rastlinky z kultivačných nádobiek najprv do črepníkov s vysterilizovanou zeminou a rastlinky otužovať tak, že postupne znižujeme vlhkosť v prostredí, kde ich pestujeme. Otužovanie je nevyhnutné, pretože pri pestovaní v kultivačných nádobách je okolo rastliniek vysoká vzdušná vlhkosť, nemajú na listoch dobre vyvinutú ochrannú vrstvičku – kutikulu, ani ich prieduchy ešte nefungujú správne. Rastlinky len postupne prechádzajú na autotrofnú výživu (kedy za využitia slnečného svetla, svojho zeleného farbiva v listoch a oxidu uhličitého zo vzduchu vytvárajú organické látky). To sa však všetko po niekoľkých dňoch upraví a rastlinky budú prosperovať v prirodzených podmienkach.
Hranie sa s pletivami
Doteraz sme sa venovali procesom, odvodeným z kalusov – teda z hojivého pletiva, ktoré vzniklo na poranení. Odborne sa tieto typy pestovaných kultúr označujú ako neorganizované kultúry. Ani tu však nekončia naše možnosti, ako sa môžeme pohrať s rastlinnou bunkou v umelom prostredí. Na pestovanie v in vitro podmienkach môžeme využiť aj už hotové, kompletné rastlinné pletivá, či orgány. Vhodná je napríklad vrcholová časť rastliny tzv. meristém. Meristémy sa nachádzajú aj v pazuchách listov.. Odoberieme z rastliny meristém? Nič sa rastline nestane, zostane živá. Oddelený meristém potom môžeme umiestniť na kultivačné médium a využiť ho na produkciu úplne zdravých rastlín, bez obsahu vírusov. Meristémy obyčajne ešte nie sú napadnuté vírusmi ani v chorej rastline, a tak v kombinácii s tepelným ošetrením (termoterapiou) získame certifikované bezvirózne rastliny. Dnes sa takto už produkujú bezvirózne jahody a maliny.
Vieme, že niektoré rastliny syntetizujú v koreňoch účinné látky. Preto z hlavného koreňa takejto rastliny kúsok odoberieme a vypestujeme z neho dlhorastúcu koreňovú kultúru. Z koreňových kultúr vieme potom získať väčšie množstvo potrebných účinných látok. Izolovať a pestovať v kultúre môžeme aj už vytvorené embryá, ktoré vznikli na rastlinách po oplodnení. Napríklad, pracovali sme na projekte, kde bolo treba vyriešiť klíčivosť semien skorých odrôd čerešní a višní. Pri týchto skorých odrodách sa rýchlo vyvíjala dužina, konzumovateľný mäsitý obal, ale embryo nestíhalo sledovať tento rýchly vývin. Priskoro odumieralo a semená z týchto plodov boli neklíčivé. Keď sme však ešte živé mladé embryá z plodov izolovali a pestovali sme ich na kultivačnom médiu, dospeli, neskôr vyklíčili a dnes sú z nich dospelé stromy. Kultúry embryí – embryokultúry – majú dnes mnohoraké využitie. Stále prinášajú veľa nových poznatkov o zákonitostiach vývinu embryí a o tom, ako ich môžeme ovplyvňovať v želanom smere. Stali sa dobrým objektom aj na sledovanie niektorých procesov látkovej premeny spojených so syntézou a rozkladom zásobných látok.
Embryokultúry možno ešte využiť aj na prekonanie niektorých problémov pri medzidruhovom a medzirodovom krížení. Pri vzdialenom krížení sa veľmi často nevytvorí pletivo, ktoré vyživuje embryo, a tak embryo odumrie. Ak sa však embryo izoluje zo semena ešte pred odumretím, možno z neho v podmienkach in vitro dopestovať hybridnú rastlinu. Podarilo sa takto dopestovať cenné krížence niektorých druhov obilnín Triticum a Elymus, Triticum a Secale, Hordeum sativum a H. bulbosum.
Tieto techniky možno s úspechom využiť aj na skrátenie doby odpočinku rastlín (dormancie) pri tých rastlinách, kde je doba odpočívania semien veľmi dlhá (napr. pri kosatci až tri roky). Ak v týchto prípadoch izolujeme embryá z obalov semien a plodu, kde sa nachádzajú látky vyvolávajúce chuť na odpočinok, môžeme získať dospelé rastliny v podstatne kratšom čase. Ich rast ešte urýchli, ak použijeme aj rastové regulátory.
Embryokultúry môžu slúžiť tiež na ozdravenie rastlinného materiálu, keďže vírusové a bakteriálne choroby sa obyčajne neprenášajú embryom (neústi do nich priamo cievny zväzok), tak sa embryokultúry využívajú aj na ozdravenie rastlinného materiálu.
Sú životaschopné?
Objasníme, ako sa zisťuje životaschopnosť semien alebo tolerancia rastlín na rôzne podmienky prostredia. Predstavme si, že chceme otestovať mrkvu na rôzne nepriaznivé životné podmienky (sucho, zasolenie, odolnosť proti hubovým ochoreniam a pod.). Keby sme tieto pokusy chceli urobiť v poľných podmienkach, zničili by sme pole na mnoho rokov. V laboratórnych podmienkach in vitro dokážeme navyše navodiť oveľa silnejšie tlaky na výber ako v poľných podmienkach.
Iba jeden rodič
Veľmi zaujímavé a hospodársky významné je aj využitie embryokultúr na získanie rastlín, ktoré majú chromozómy len od 
jedného rodiča. Takéto rastliny nazývame haploidné. Pri niektorých medzidruhových kríženiach jačmeňa (napr. Hordeum vulgare a H. bulbosum) sa pri prvých deleniach jadra oplodneného vajíčka postupne potláčajú chromozómy jedného z rodičov (H. bulbosum). V bunkách ostávajú jadrá len s polovičným počtom chromozómov (H. vulgare). Z izolovaných mladých embryí sa v podmienkach in vitro darí vypestovať rastliny len s jednou chromozómovou výbavou. Potom sa z nich však pôsobením napríklad rastlinného alkaloidu kolchicínu môžu stať rastliny s dvoma súpravami chromozómov, ale s rovnakými dedičnými znakmi, takže sa dokážu ďalej rozmnožovať, no ich vlastnosti sa nemiešajú. Pre šľachtiteľov sú veľmi cenným rastlinným materiálom.
Haploidné rastliny možno ešte získať aj kultiváciou nezrelých rastlinných pohlavných buniek (gamét). Môžeme využívať nezrelé peľové zrná alebo bunky zárodočného mieška vo vajíčkach. Z nezrelých gamét možno pri presne stanovených podmienkach vypestovať haploidné rastliny. Tie sa potom stávajú cenným šľachtiteľským materiálom pre produkciu tzv. čistých línií. Klasické postupy na dosiahnutie čistých línií vyžadujú 6 až 7 rokov spätného kríženia na to, aby sa dosiahla vyhovujúca úroveň rovnakých vlastností, dedičných znakov. Nazývame ich homozygótne rastliny. Pri využití techník peľnicových a mikrospórových kultúr sa to dá dosiahnuť v rámci jednej generácie. Šľachtitelia využívajú homozygótne jedince ako výsledné odrody pri samoopelivých druhoch rastlín a ako rodičovské línie pre prípravu F1 hybridov pri cudzoopelivých druhoch rastlín. Keď mnohí záhradkári vidia úrody takýchto vyšľachtených hybridov, ľahko môžu podľahnúť pokušeniu, aby si odložili semienka z tohtoročnej skvelej úrody aj pre budúci rok. Len tí skúsení vedia, že semená hybridov F1 nemá zmysel odkladať, pretože si svoje skvelé vlastnosti s najväčšou pravdepodobnosťou pre budúci rok nezachovajú.
Umelé semená
Aby sme dokreslili celkový obraz o tom, čo kultúry in vitro umožňujú, musíme ešte spomenúť proces somatickej embryogenézy. Ide o proces, pri ktorom dokážeme v kultúre in vitro za presne definovaných podmienok a s využitím rastových regulátorov vyvolať tvorbu embryí v telových bunkách rastliny (nie splynutím pohlavných buniek). Výhodou tohoto procesu je, že sa tak v jednom kroku vytvorí štruktúra, ktorá nesie aj rastový aj koreňový pól – čiže takáto rastlina dokáže rásť dohora a zároveň vytvárať koreňový systém. Tak sa rieši problem, kedy sa v kultúre in vitro pri zakoreňovaní výhonkov často stáva, že cievny zväzok s vodivými pletivami v koreni nie je priamym pokračovaním vodivého zväzku výhonku, a tak by výhonok neskôr uhynul.
Somatické embryá možno pripraviť vo veľkom množstve a možno ich upraviť ako umelé semená a ďalej s nimi narábať ako s bežnými semenami. Somatické embryá sa preto obaľujú v hydrogéloch, ktorý embryá chráni pred poškodením a môže poskytovať aj výživné látky pre klíčenie.
Využitie pletivových kultúr
Mnohoročným intenzívnym výskumom vznikol základ pre začlenenie laboratórne pripravených kultúr do bežnej poľnohospodárskej a záhradníckej praxe. V praxi je možné využiť techniky pletivových kultúr na namnoženie cenného rastlinného materiálu a získať tak rastliny navlas rovnaké ako rodičovská rastlina. Proces sa nazýva mikropropagácia. Bežne sa dnes využíva na produkciu okrasných rastlín, hlavne v Holandsku.
Z rastlinných pletív pestovaných v in vitro podmienkach môžeme získať aj rastliny s novými kvalitami (napr. odolné rastliny proti niektorým plesniam, suchu či zasoleniu pôdy). Keďže rastliny obsahujú mnohé pre ľudí atraktívne bioaktívne látky, je výhodné využiť pletivové kultúry aj na ich produkciu (silíc, éterických olejov, farbív). Niekedy sa v pletivových kultúrach dá dosiahnuť aj niekoľkonásobne vyššia produkcia takýchto látok ako z rastlín v prírodných podmienkach, prípadne môžeme získať iné, kvalitnejšie zloženie. Pre takéto ciele boli vypracované špeciálne postupy, napríklad kultivácia bunkových kultúr v bioreaktoroch a imobilizované kultúry (bunky zachytené na rôznych nosičoch). Pletivové kultúry je možné dlhodobo uchovávať (napr. využitím zmrazovania – kryoprezervácie ) tiež ako cenné genetické zdroje, čo je nevyhnutná potreba pre šľachtiteľov.
Pletivové kultúry sa v priebehu rokov stali jedným z hlavných pilierov rastlinných biotechnológií. Aj preto, lebo dostupnými technikami dokážeme upravovať rastliny doslova na mieru. Európsky parlament vyhlásil 3. tisícročie za tisícročie biotechnológií, uvedomujúc si význam rastlín pre život vôbec a možnosti úpravy rastlín nástrojmi, ktoré poskytuje súčasná veda. Veda o rastlinách je oblasť širokých možností, ktorá si vyžaduje zvýšenú pozornosť. Investovanie do výskumu rastlín je investovaním do budúcnosti.
Autori: prof. RNDr. Anna Preťová, DrSc., Ing. Eva Űrgeová, PhD.; Katedra biológie, Fakulta prírodných vied, Univerzita sv. Cyrila a Metoda v Trnave
Foto: prof. RNDr. Anna Preťová, DrSc.; Fotky&foto (úvodná fotka)
Viac sa dočítate v časopise Quark (číslo 3/2015).
UVerejnila: ZČ